Función de la ciclina O en la regulación de la apoptosis y en la transformación tumoral.
En la mayoría de los tejidos de un organismo existe un frágil equilibrio entre los procesos de división celular, diferenciación y muerte celular, tanto durante el desarrollo embrionario como durante la vida adulta. La carcinogénesis es el resultado final de varias etapas que se producen por la acumulación de diversos defectos en la diferenciación, proliferación y muerte celular. La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso fisiológico relacionado con la regulación del número de células de un organismo mediante la eliminación de las células dañadas o no deseadas. Los defectos en la apoptosis están directamente relacionados tanto con defectos en el desarrollo normal del organismo, como con la tumorigénesis o con los tratamientos antineoplásicos. Los agentes quimioterapéuticos y físicos (radiaciones ionizantes) utilizados en la lucha contra las enfermedades neoplásicas aprovechan los mecanismos celulares normales de la apoptosis para sus fines. Este hecho establece una clara relación entre el desarrollo tumoral y la resistencia intrínseca al tratamiento antineoplásico. (Johnstone et al., 2002).
Las células han desarrollado mecanismos conservados a lo largo de la evolución que aseguran la correcta replicación de su material genético y su distribución en las células hijas. Además, los organismos pluricelulares han desarrollado mecanismos bioquímicos que permiten eliminar las células dañadas o inútiles y hacer desaparecer sus cuerpos. A pesar de sus aparentes funciones opuestas, los procesos de muerte, división y diferenciación celular comparten similitudes que se reflejan a nivel molecular en el uso de pasos bioquímicos comunes (Launay et al., 2005). Entre ellos, se ha observado que la activación de las quinasas dependientes de ciclinas (CdK) es decisiva tanto en la mitosis como en la apoptosis (Golsteyn, 2005). Las Cdk son una familia de quinasas de serina y treonina que comparten una gran homología estructural y, a pesar de su función es heterogénea, comparten un mecanismo de activación común que implica su unión a la subunidad de ciclina. Se ha aceptado el hecho de que las ciclinas y las Cdk desempeñan una función importante en la regulación del ciclo celular. Esta afirmación se basa en la recopilación de datos de enfoques genéticos y bioquímicos. Sin embargo, su función en la apoptosis ha sido mucho más controvertida, debido a la falta de pruebas genéticas y debido también probablemente a la diversidad de modelos y metodologías celulares utilizadas. De hecho, se han llegado a publicar datos contradictorios. Todas estas aproximaciones tienen en común la sobreexpresión no programada de los componentes, en otro caso normales, del ciclo celular (Golsteyn, 2005) o la expresión de activadores del ciclo celular en células atrofiadas en presencia de mitógenos para obligar a la célula a reeintroducirse en el ciclo celular. La mayoría de estos experimentos se realizaron en líneas celulares proliferantes, lo que hace imposible discernir entre la activación de un regulador del ciclo celular, dado que actúa supuestamente en la apoptosis, y su función normal en la regulación del ciclo celular. Los timocitos representan un modelo apropiado para estudiar las interconexiones entre la apoptosis y el ciclo celular, ya que un 90% de las células de un timo normal son quiescentes (Brady et al., 1996) y no evolucionan en el ciclo celular in vitro a excepción de cuando se encuentran en unas condiciones muy sofisticadas (revisado en (Schmitt y Zuniga-Pflucker, 2006)). Por lo tanto, cualquier activación de las quinasas relacionada con el ciclo celular no debería estar necesariamente asociada a una evolución del ciclo celular. Se ha demostrado que la activación de la Cdk2 es necesaria en la apoptosis de células quiescentes como los timocitos (Gil-Gómez et al., 1998), neuronas (sin resultados publicados) y células endoteliales agonizantes por la pérdida de factores tróficos (Levkau et al., 1998). Esta activación está controlada por proteínas reguladoras de la apoptosis, como la p53, Bcl2 o Bax, y resulta específica ya que otros miembros de la familia Cdk, como la Cdk1, no están activadas en las mismas condiciones (Gil-Gómez et al., 1998; Gil-Gómez, 2004). La Cdk2 puede estar negativamente regulada principalmente por las Cdks p27Kip1, p21Cip1 y p130 (Cotas et al., 1999).
En nuestro laboratorio hemos demostrado (Granés et al., 2004) que la activación de Cdk2 constituye una etapa muy inicial que tiene lugar antes de que la membrana plasmática pierda su asimetría. La caspasa apical como la caspasa-8 se activa y los miembros de la familia Bcl2, Bax y Bid, se translocan a la mitocondria e inducen la disfunción mitocondrial que finalmente libera el citocromo c en el citoplasma. En cuanto a la activación de la CdK2 durante la apoptosis (ARCA), hemos aislado y caracterizado una nueva ciclina (ciclina O) que puede unir y activar Cdk2. Se produce antes de la apoptosis, es inducida por un daño en el DNA o por un tratamiento glucocorticoide (estímulos intrínsecos) en timocitos de ratón y es necesaria en la apoptosis para un modelo de células linfoides de cultivo (Roig et al., presentado).
1. Estudio bioquímico del efecto proapoptósico de la ciclina O
El objetivo de esta parte del proyecto consiste en continuar los estudios dirigidos a caracterizar los mecanismos moleculares de inducción a la apoptosis mediante la ciclina O e iniciar el estudio del mecanismo bioquímico del efecto antiapoptósico de las células que sobreviven a la sobreexpresión de la ciclina O.
Partimos de las células WEHI7.2 transfectadas de forma estable con un vector de expresión de shRNA para la ciclina O (Brummelkamp et al. 2002) para ubicar bioquímicamente el defecto que hace que las células sean resistentes a la apoptosis inducida por estímulos intrínsecos. Con este objetivo vamos a estudiar la funcionalidad de los pasos conocidos de la vía del daño del DNA en las células de control WEHI7.2 y los clones en los que se ha reducido la ciclina O mediante un shRNA para localizar en qué punto se detiene la señal apoptósica.
Al utilizar los clones supervivientes U2OS de la figura 2, que expresan niveles bajos de mciclina O y son enormemente resistentes a la apoptosis inducida por radiación α, hemos decidido estudiar la causa de este efecto. Los resultados preliminares nos indican que no se debe a mecanismos obvios como la sobreexpresión de Bcl2, sino más bien parece que la vía de daño del DNA es defectuosa y las respuestas no se ejecutan correctamente. Tenemos pensado acabar estos experimentos intentando localizar el defecto exacto en la vía.
2. Participación de la ciclina O en la diferenciación epitelial y la tumorigénesis
El objetivo de esta parte consiste en caracterizar los efectos de la ciclina O en modelos de diferenciación de líneas celulares de carcinoma epitelial de colon y sus propiedades tumorales.
Partiremos del hecho de que todos los modelos celulares epiteliales tumorales que están bien caracterizados en la unidad (la mayoría de líneas celulares de carcinoma de colon) expresan niveles elevados de ciclina O. Pensamos reducir los niveles de ciclina O en dos de los modelos mejor definidos mediante shRNA y estudiar el fenotipo de las células modificadas en términos de diferenciación (expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales y formación de monocapas epiteliales polarizadas), apoptosis (anoikis, supervivencia tras la retirada del suero) y resistencia a tratamientos quimioterapéuticos (radiación α, 5-fluorouracilo, metotrexato, etc.). Para esta parte y la siguiente contamos con la ayuda del Dr. Antonio García de Herreros.
Como consecuencia de la reducción de la ciclina O, es posible que las propiedades tumorales de las células varíen en base a lo descrito en el apartado anterior. Proponemos verificar su comportamiento in vivo inyectándolas en ratones atímicos y estudiar su capacidad para formar tumores en la zona de inyección y en otras zonas más alejadas (metástasis). También será interesante comparar las propiedades tumorigénicas de las células U2OS salvajes con los clones U2OS que expresan ciclina O y les confiere un fuerte efecto antiapoptósico. El Dr. F. Alameda del Departamento de Patología del Hospital del Mar, con el cual colaboramos desde hace mucho tiempo, eliminará y analizará histológicamente los tumores formados. El trabajo inmunohistoquímico lo realizará Marta Garrido.
3. Estudio bioquímico del papel de la ciclina O en la respuesta al estrés celular
En esta parte proponemos continuar los experimentos que iniciamos recientemente en cuanto a la función de la ciclina O en la respuesta al estrés celular. Principalmente hemos descubierto que la ciclina O localiza los cuerpos del estrés (véase la Figura 1) cuando las células están estresadas por diferentes tratamientos. Hasta ahora se desconoce su papel en este punto.
Tenemos pensado plantear la cuestión de qué dominio de la proteína es responsable de la translocación de los cuerpos del estrés y, si es así, por ejemplo mediante interacción directa con TIA-1, una proteína integral de los cuerpos del estrés a y con cual se colocaliza. Disponemos de un mutante triple de la ciclina que forma cuerpos del estrés continuamente, incluso en células no estresadas. Por lo tanto, ya tenemos una pista de la localización del dominio de interacción.
Además, deseamos verificar si la ciclina O es necesaria para la formación de cuerpos del estrés. Para realizar este experimento, hemos pensado inducir el estrés celular en células U2OS transfectadas establemente con un shRNA de ciclina O y utilizar la proteína verde fluorescente mejorada TIA-1 transfectada transitoriamente y/o la proteína roja fluorescente eIF2α como marcadores.
La sobreexpresión de la ciclina O provoca la inactivación del factor de traducción general eIF2α por fosforilación en Ser51. Pensamos seguir definiendo bioquímicamente este efecto, estudiar qué quinasa eIF2α es responsable del efecto y cómo se conecta con el efecto proapoptósico de su sobreexpresión transitoria. Contaremos con la colaboración del Dr. Raúl Méndez del CRG, experto en esta materia.
4. Estudio de la expresión de la ciclina O en tumores humanos
Pensamos realizar estudios de expresión en tejidos humanos adultos y en muestras de tumores seleccionadas. A partir de una investigación inicial vimos que la hciclina O está sobreexpresada en un gran número de tumores humanos, en su mayoría adenocarcinomas. Nuestra idea es finalizar estos estudios de sobreexpresión en tumores de origen epitelial y extenderlo a otro tipo de tumores en los que la ciclina se expresa en condiciones normales, como es el caso de los tumores mesenquimales.
5. Generación de modelos murinos para el estudio in vivo de la función de la ciclina O
El hecho de que sólo exista un único gen de ciclina O en el genoma del ratón, que su secuencia sea muy diferente a la del resto de ciclinas y que su expresión se haya detectado tan pronto como en E5.5 nos animó a generar un KO provisional en caso de que su supresión causara mortalidad embrionaria prematura y descartara futuros análisis. Pensamos llevara a cabo esta parte del proyecto en colaboración con el Dr. Anton Berns en el Netherlands Cancer Institute de Ámsterdam. Esto reduciría el precio del proyecto y nos beneficiaríamos de sus conocimientos en generación y determinación del fenotipo de los ratones modificados genéticamente.
Además de los colaboradores mencionados en la sección anterior, mantenemos colaboraciones estables con el Dr. Hugh Brady del Insitute of Child Heath de Londres.
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